ABCMdb

ABCD1 p.His667Asp

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PMID: 11748843 [PubMed] Kemp S et al: "ABCD1 mutations and the X-linked adrenoleukodystrophy mutation database: role in diagnosis and clinical correlations."

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174 P560S 7 1678C>T n.d. # P560L 7 1679C>T Reduced P560L 7 1679C>T Reduced fs I588 7 1765delC n.d. # R591P 7 1772G>C Absent S606L 8 1817C>T Present E609K 8 1825G>A Absent E609K 8 1825G>A Absent R617C 8 1849C>T Absent R617H 8 1850G>A Absent R617H 8 1850G>A Absent A626T 9 1876G>A Absent A626T 9 1876G>A Absent A626D 9 1877C>A n.d. # E630G 9 1889A>G n.d. # C631Y 9 1892G>A n.d. # T632I 9 1895C>T n.d. # V635M 9 1903G>A n.d. # L654P 9 1961T>C Absent # R660W 9 1978C>T Absent fs L663 9 1988insT n.d. # fs L663 IVS 9 IVS9+1g>a n.d. # fs L663 IVS 9 IVS9-1g>a n.d. # H667D 10 1999C>G Absent # T668I 10 2003C>T Absent # T693M 10 2078C>T Present # exon1-5del 1-5 n.d. # The 47 mutations marked with a # are novel unique mutations reported for the first time in this paper. Login to comment

PMID: 21476988 [PubMed] Zhang X et al: "Conservation of targeting but divergence in function and quality control of peroxisomal ABC transporters: an analysis using cross-kingdom expression."

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153 Approximately 60% of X-ALD ABCD1 mutations are missense mutations, 65% of which result in no detectable ALDP, based on IF (immunofluorescence), indicating that they affect protein Table 1 Quantification of ALDP levels in X-ALD fibroblasts ALDP Mutation IF Immunoblot (% of control) p.Arg74Trp Absent 7.5 + - 0.6 p.Arg104Cys Reduced 35 + - 3.0 p.Ser149Asn Present 77 + - 3.0 p.Asp194His Present 60 + - 13.6 p.Leu220Pro Reduced 21.8 + - 5.4 p.Arg389His Present 40.6 + - 3.6 p.Arg554His Absent 1.0 + - 0.5 p.Ser606Leu Present 25 + - 1.5 p.Glu609Gly Absent 2.1 + - 1.3 p.Glu609Lys Absent 1.8 + - 0.9 p.Ala616Thr Absent 4.3 + - 1.7 p.Leu654Pro Absent 1.5 + - 1.3 p.Arg660Trp Absent 1.6 + - 0.8 p.His667Asp Absent 2.9 + - 1.0 p.Arg113fs Absent - Figure 3 Interaction of mammalian ABCD proteins with Arabidopsis Pex19 in vivo Tobacco plants stably expressing CFP-SKL were co-transfected with 35S::ABCD-YFP fusions andNLS-Pex19constructs.Leafepidermalcellswereimagedusingconfocalmicroscopy:(A-D) ALDP-YFP plus NLS-HsPex19; (E-H) ALDP-YFP plus NLS-AtPex19_1; (I-L) ALDR-YFP plus NLS-AtPex19_1. Login to comment
181 These included relatively common mutants which are unstable in fibroblasts, but which can be rescued by the application of proteasome inhibitors (p.Ser606Leu, p.Arg617His and p.His667Asp), the p.Arg104Cys mutant in which degradation of ALDP cannot be prevented by proteasome inhibitors and the p.Tyr174Cys mutant which is Table 2 X-ALD mutants used for analysis of targeting in tobacco cells The occurrence is the number of documented patients bearing the mutation; source: X-ALD database (http://www.x-ald.nl). Login to comment
154 Approximately 60% of X-ALD ABCD1 mutations are missense mutations, 65% of which result in no detectable ALDP, based on IF (immunofluorescence), indicating that they affect protein Table 1 Quantification of ALDP levels in X-ALD fibroblasts ALDP Mutation IF Immunoblot (% of control) p.Arg74Trp Absent 7.5 + - 0.6 p.Arg104Cys Reduced 35 + - 3.0 p.Ser149Asn Present 77 + - 3.0 p.Asp194His Present 60 + - 13.6 p.Leu220Pro Reduced 21.8 + - 5.4 p.Arg389His Present 40.6 + - 3.6 p.Arg554His Absent 1.0 + - 0.5 p.Ser606Leu Present 25 + - 1.5 p.Glu609Gly Absent 2.1 + - 1.3 p.Glu609Lys Absent 1.8 + - 0.9 p.Ala616Thr Absent 4.3 + - 1.7 p.Leu654Pro Absent 1.5 + - 1.3 p.Arg660Trp Absent 1.6 + - 0.8 p.His667Asp Absent 2.9 + - 1.0 p.Arg113fs Absent - Figure 3 Interaction of mammalian ABCD proteins with Arabidopsis Pex19 in vivo Tobacco plants stably expressing CFP-SKL were co-transfected with 35S::ABCD-YFP fusions andNLS-Pex19constructs.Leafepidermalcellswereimagedusingconfocalmicroscopy:(A-D) ALDP-YFP plus NLS-HsPex19; (E-H) ALDP-YFP plus NLS-AtPex19_1; (I-L) ALDR-YFP plus NLS-AtPex19_1. Login to comment
182 These included relatively common mutants which are unstable in fibroblasts, but which can be rescued by the application of proteasome inhibitors (p.Ser606Leu, p.Arg617His and p.His667Asp), the p.Arg104Cys mutant in which degradation of ALDP cannot be prevented by proteasome inhibitors and the p.Tyr174Cys mutant which is c The Authors Journal compilation c Table 2 X-ALD mutants used for analysis of targeting in tobacco cells The occurrence is the number of documented patients bearing the mutation; source: X-ALD database (http://www.x-ald.nl). Login to comment

PMID: 17542813 [PubMed] Takahashi N et al: "Adrenoleukodystrophy: subcellular localization and degradation of adrenoleukodystrophy protein (ALDP/ABCD1) with naturally occurring missense mutations."

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2 In this study, we chose nine arbitrary mutant human ALDP forms (R104C, G116R, Y174C, S342P, Q544R, S606P, S606L, R617H, and H667D) with naturally occurring missense mutations and examined the intracellular behavior. Login to comment
3 When expressed in X-ALD fibroblasts lacking ALDP, the expression level of mutant His-ALDPs (S606L, R617H, and H667D) was lower than that of wild type and other mutant ALDPs. Login to comment
4 Furthermore, mutant ALDP-green fluorescence proteins (S606L and H667D) stably expressed in CHO cells were not detected due to rapid degradation. Login to comment
7 When CHO cells expressing mutant ALDP-green fluorescence protein (H667D) were cultured in the presence of a proteasome inhibitor, both the mutant and wild type ALDP reappeared. Login to comment
9 These results suggest that mutant ALDPs, which have a mutation in the COOH-terminal half of ALDP, including S606L, R617H, and H667D, were degraded by proteasomes after dimerization. Login to comment
35 We found that mutant ALDPs with the missense mutations in the G116R S342P Q544R R617H H667D Y174C NH2 COOH C sequence Cytosol Membrane Matrix Walker A Walker B S606P, S606L R104C Fig. 1 A putative secondary structure of adrenoleukodystrophy protein. Login to comment
71 CHO-K1 cells (5 · 105 cells) were cultured in Ham`s F-12 medium with 10% FBS, 70 lg/mL of penicillin, and 140 lg/mL of streptomycin and transfected with 5 lg of pMAM2/ Table 1 Oligonucleotide primer sequences used for the generation of mutant ALDP constructs Construct name Forward primer (5' to 3') (top) R104C GCCTTGGTGAGCTGCACCTTCCTGTCG G116R GCCCGCCTGGACAGAAGGCTGGCC Y174C GCCTACCGCCTCTGCTCCTCCCAG S342P TGGAGCGCCCCGGGCCTGCTCATG Q544R GCATGTTCTACATCCCGCGGAGGCCCTACATGTC S606P AAGGACGTCCTGCCGGGTGGCGAGAAG S606L AAGGACGTCCTGTTGGGTGGCGAGAAG R617H GCAGAGAATCGGCATGGCCCACATGTTCTACCACAGGC H667D TCCCTGTGGAAATACGACACACACTTGCTA The underlined letters indicate the single base mutation leading to an amino acid replacement. Login to comment
120 However, the ratios of certain His-ALDPs (S606L, R617H, and H667D) were significantly lower than those of wild type His-ALDP and other mutant His-ALDPs. Login to comment
123 Therefore, we focused our attention on mutant ALDP (S606H, R617H, and H667D) and examined the expression level with co-expression of GFP. Login to comment
125 Taken together, it appears His-ALDP (S606L, R617H, and H667D) might be degraded after translation. Login to comment
128 In contrasts, His-ALDPs (Y174C and H667D) appear to be mislocated to other organelles. Login to comment
135 In this experiment, we chose R104C, G116R, and S606P (with normal localization in peroxisomes), Y174C (mislocalization), and S606L and H667D (degradation). Login to comment
141 In contrast, mutant ALDP-GFP (S606L and H667D) was not detected in any subcellular fractions although PMP70 and catalase were recovered in fractions 2 and 3. Login to comment
150 The fragments were not extractable with 0.1 mol/L sodium carbonate, indicating (a) (c) (b) (d) 400 140 120 100 Expressionratio(%) 80 60 40 His-ALDP R104C G116R Y174C S342P Q544R S606P S606L R617H H667D Catalase 20 0 100 Expressionratio(%) 80 60 40 20 0 350 300 250 200 150 pmol/h/mgprotein 100 50 0 Normal (139T) X-ALD (163T) M ock M ock W ild W ild N one S606L His-ALDP GFP Catalase R 617H H 667D R 104CG 116RY174C S342PQ 544RS606PS606LR 617HH 667D M ock W ildR 104CG 116RY174CS342PQ 544RS606PS606LR 617HH 667D Fig. 3 Expression of wild type and mutant His-adrenoleukodystrophy proteins (ALDPs) in X-linked adrenoleukodystrophy (X-ALD) fibroblasts (163T). Login to comment
159 (c) Co-expression of wild or mutant His-ALDP (S606L, R617H, or H667D) with green fluorescence proteins (GFP). Login to comment
169 Effect of proteasome inhibitors on mutant ALDP The transient and stable expression experiments of mutant ALDPs suggest that mutant ALDPs such as S606L, R617H, H667D, and R104C are degraded by proteases. Login to comment
170 As CHO cells stably expressed wild type ALDP and mutant ALDP-GFP (H667D) did not show any immunodetectable proteins corresponding to ALDP or ALDP-GFP, we attempted to inhibit the degradation of ALDP-GFP (H667D) by treatment with several protease inhibitors. Login to comment
175 Furthermore, we analyzed where ALDP-GFP (H667D) was located in the cells after treatment with MG132. Login to comment
177 In the absence of MG132, CHO cells expressing mutant ALDP-GFP (H667D) did not show any fluorescent dots after the permeabilization by digitonin (data not shown). Login to comment
178 As in Fig. 6, in the presence of MG132, immunofluorescent dots of mutant ALDP-GFP (H667D) were detected and the dots were superimposable on the pattern of PMP70. Login to comment
179 Newly synthesized ALDP-GFP (H667D) might escape from degradation in cytosol and target peroxisomes or localize on peroxisomal membranes after targeting to peroxisomes. Login to comment
180 Degradation of mutant ALDP (S606L) was similarly inhibited by lactacystin, but not by leupeptin, wild R104C G116R ALDP-GFP ALDP PMP70 1 5 10 1 5 10 1 5 10 1 5 10 1 5 10 1 5 10 1 5 10 Non specific ALDP-GFP ALDP PMP70 Non specific ALDP-GFP ALDP PMP70 Non specific Y174C H667D S606P S606L Fig. 4 Subcellular localization of wild type and mutant adrenoleukodystrophy protein (ALDP) -green fluorescence proteins (GFP) in CHO cells. Login to comment
181 The mitochondrial and light mitochondrial fraction from CHO cells expressing wild type ALDP and ALDP-GFP or each mutant ALDP-GFP (R104C, G116R, Y174C, S606P, S606L, or H667D) was fractionated by equilibrium density centrifugation on sucrose. Login to comment
191 These results suggest that missense mutations, including R617H and H667D, were also degraded by proteasomes. Login to comment
195 Some mutations in the first extracellular domain of ABCA1 have been shown to cause impaired localization of the mutant ABCA1 to plasma membranes from the ALDP-GFP(H667D) ALDP 100 Lactacystin MG132 kDa kDa 0 100 75 2.5 5 10 10 20 kDa 0 100 75 2.5 5 10 20 ALDP-GFP(H667D) ALDP ALDP-GFP(H667D) ALDP µmol/L h 75 70 (a) (b) (c) Leupeptin AEBSF E-64-dLactacystin None PMP70 Fig. 5 Effect of protease inhibitors on the stability of adrenoleukodystrophy protein (ALDP)-green fluorescence proteins (GFPs) (H667D) and wild type ALDP in CHO cells. Login to comment
196 (a) CHO cells co-expressing wild type ALDP and ALDP-GFP (H667D) were cultured with leuteptin (50 lmol/L), AEBSF (300 lmol/L), E64-d (10 lmol/L), or lactacystin (10 lmol/L) for 20 h. Cell homogenates (100 lg of protein) were analyzed by immunoblotting using anti-ALDP and anti-PMP70 antibodies. Login to comment
197 (b) CHO cells co-expressing wild type ALDP and ALDP-GFP (H667D) were incubated with different concentrations of lactacystin or MG132 for 20 h and subjected to immunoblot analysis as in (a). Login to comment
198 (c) CHO cells co-expressing wild type ALDP and ALDP-GFP (H667D) were incubated with 10 lmol/L MG132 for 0-20 h. ALDP-GFP (a) (b) (c) (d) (e) (f) PMP70 MERGE Fig. 6 Distribution of mutant adrenoleukodystrophy protein (ALDP) -green fluorescence proteins (GFPs) (H667D) in CHO cells incubated with MG132. Login to comment
199 CHO cells co-expressing wild type ALDP and mutant ALDP-GFP (H667D) were incubated with 10 lmol/L MG132 for 20 h. They were then incubated with or without digitonin (25 lg/mL) for 10 min followed by immunostaining. Login to comment
200 CHO cells expressing mutant ALDP-GFP (H667D). Login to comment

PMID: 15800013 [PubMed] Asheuer M et al: "Decreased expression of ABCD4 and BG1 genes early in the pathogenesis of X-linked adrenoleukodystrophy."

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76 Mutation Amino acid alteration Type of mutation at the protein level Tissue sample CCER1 521A.G Y174C Missense CCER2 1414insC fsE471 Frame shift CCER3 Unknown Unknown Unknown Fibroblast CCER4 411G.A W137X Nonsense CCER5 1961T.C L654P Missense CCER6 529C.T Q177X Nonsense CCER7 901-1G.A fsE300 Frame shift CCER8 796G.A G266R Missense CCER9 1822G.A G608S Missense Brain CCER10 1390C.A R464X Nonsense CCER11 253-254insC fsP84 Frame shift CCER12 619_627del S207_A209del Deletion AMN-C1 1414-1415insC fsE471 Frame shift AMN-C2 1661G.A R554H Missense AMN-C3 1585delG fsG528 Frame shift Fibroblast AMN-C4 1661G.A R554H Missense AMN-C5 1825G.A E609K Missense AMN-C6 919C.T Q307X Nonsense AMN-C7 1850G.A R617H Missense AMN-C8 887A.G Y296C Missense AMN-C9 965T.C L322P Missense Brain AMN-C10 1390C.T R464X Nonsense AMN-C11 [1165C.T;1224 þ 1GT.TG] [R389C;fSE408] Missense; frame shift AMN-C12 1661G.A R554H Missense AMN-C13 [1997A.C;2007C.G] [Y666S;H669Q] Missense AMN-C14 1755delG fsH586 Frame shift AMN1 529C.T Q177X Nonsense AMN2 1999C.G H667D Missense AMN3 1415delAG fsE471 Frame shift Fibroblast AMN4 337delC fsA112 Frame shift AMN5 310C.T R104C Missense AMN6 919C.T Q307X Nonsense AMN7 323C.T S108L Missense Brain All mutation designations conform to the nomenclature described by Antonarakis and den Dunnen (30,31). Login to comment

PMID: 17202797 [PubMed] Takahashi N et al: "[Adrenoleukodystrophy: structure and function of ALDP, and intracellular behavior of mutant ALDP with naturally occurring missense mutations]."

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8 We found that mutant ALDP (S606L, R617H, and H667D) was degraded together with wild-type ALDP by proteasomes. Login to comment
20 R617H and H667D are located in Walker B region and in COOH-terminal region, respectively. Login to comment
28 ミスセンス変異を持つ ALDP の細胞内動態 ―一過性発現による解析 ALD 患者の持つ変異 ALDP のڥf;能,細胞内局在性,細胞内における安定性を解析することは, ALDP の各ドメインの機能を知る上で有用な情報を提供すると思われる．特にミスセンス変異は,たった 1 つのアミノ酸変異による異常であるので特に興味深い．われわれは ALD 患者で報告されているミスセンス変異の中から,TMD から 4 つ(R104C, G116R, Y174C, S342P),NBD から 4 つ(Q544R, S606P, S606L, R617H),C 末端部位から 1 つ (H667D)を任意に選び(Fig. 1),その機能と細胞内動態を解析した．これらの実験は,大学院シンポジウムで報告したので,詳しく述べたいと思う． ALDP はペルオキシソームにおける極長鎖脂肪酸の b 酸化に関与していることが知られている．実際に ALD 患者由来の繊維芽細胞では極長鎖脂肪酸の b 酸化活性が正常な線維芽細胞と比べて約 50 ―70%程度減少している．そこで野生型及び変異型 ALDP の機能を確認するため,ALDP を発現していない ALD 患者由来線維芽細胞に,N 末端に His タグを付加した野生型と変異型 ALDP を一過性に発現し,［1-14 C]lignoceric acid を基質として極長鎖脂肪酸 b 酸化活性の測定を行った．その結果, ALDP 欠損線維芽細胞の極長鎖脂肪酸 b 酸化活性は,正常細胞の約 50%まで減少していたが,野生型 His-ALDP を発現させると正常と同程度にまで活性が回復した．このことから発現させた野生型 His-ALDP は ALDP と同等の機能を持つことが確認された．一方,9 種類のミスセンス変異 ALDP を発現した線維芽細胞では極長鎖脂肪酸 b 酸化活性の増加は認められなかった．よって,これらのミスセンス変異 ALDP は機能を欠くことが確認された．ついで,野生型及び変異型 His-ALDP を発現した ALD 患者線維芽細胞を回収し,変異型 ALDP の発現量を immunoblotting により定量化し解析した(Table 1)．なお ALDP の発現量は,ペルオキシソームの指標酵素であるカタラーゼの発現量で補正した．その結果,変異型 ALDP(R104C, G116R, Y174C, S342P, Q544R, S606P)は,野生型とほぼ同程度の発現量を示した．一方,変異型 ALDP (S606L, R617H, H667D)では発現量が野生型の発 167 Table 1. Login to comment
29 Expression and Localization of Missense ALDPs Mutant Transient Stable Expression Localization b-Oxidation Expression Localization Wild Z Px ＋ Z Px R104C, G116R S342P, Q544R S606P Z Px － Z Px Y174C Z mis － Z mis S606L ＋ Px －－－ R617H ± －－ na na H667D ＋－－－－ Wild and Mutant His-ALDPs or ALDP-GFPs were transiently expressed in X-ALD ˆbroblasts and stably expressed in CHO cells, respectively. Login to comment
36 1 現量と比べて約 50%程度減少していた．なお,各 ALDP ポジティブの細胞は約 30%程度であり,各細胞間での発現効率に有意な差は認められなかった．このことから,ALDP の発現量が減少していた 3 つの変異 ALDP は細胞内での安定性が低下していると推察された．また興味深いことに S606P と S606L は同じ部位の変異にも係わらず,置換したアミノ酸によって発現量には差が認められた．ついで,変異型 His-ALDP の細胞内局在を蛍光抗体法で確認した．変異型 ALDP(R104C, G116R, S342P, Q544R, S606P, S606L)では ALDP がカタラーゼの局在と一致したことから,正常にペルオキシソームへ局在していることが確認された．一方, 変異型 ALDP(Y174C, H667D)では局在が一致せず,ALDP が他の細胞内小器官へ間違って輸送されていると考えられた．変異型 ALDP(R617H) では ALDP の発現が認められなかった．変異型 ALDP(R104C, G116R, S342P, Q544R, S606P)では野生型とほぼ同程度のタンパク量が発現し,ペルオキシソームへの局在も確認されたので,これらの変異型 ALDP は合成されたのちに正常にペルオキシソームに運ばれるが,ペルオキシソーム膜においてその機能(ATP 結合・加水分解若しくは基質輸送)に異常を持つことが推察された．特に R104C, G116R, S342P は TMD に存在することから ALDP の基質輸送能が変化していると考えられる．一方, NBD に存在する Q544R, S606P は ATP 結合・加水分解に影響を与えている可能性が考えられる．また S606P, S606L は変異が同じ部位でも構造的に安定性が異なっていた．Roerig らは S606L の変異型 ALDP は,ATP との親和性が低下している一方で ATP 加水分解は正常に行われていると報告している．29) このことは ALDP と ATP の親和性が ALDP の安定性にも影響を及ぼしている可能性を示している．S606L と S606P の安定性の違いと機能の関係は ALDP の機能を知る上でも興味深い点であり, 今後さらに検討を行う必要がある．一方,Y174C の変異型 ALDP は正常に発現するにも係わらず, ペルオキシソームへ局在せず他の細胞内小器官へミスターゲッティングした．これまでにペルオキシソームへの局在化シグナルを欠くペルオキシソーム膜タンパク質は,非特異的にミトコンドリアや小胞体に移行することが知られている．30,31) よって, ALDP の TMD2―3 の間のループは,ペルオキシソームへの局在化に重要な役割を果たしている可能性が推察される．Pex19p 存在化での in vitro タンパク質翻訳系において,ALDP(Y174C)は Pex19p に結合できるので,ALDP の N 末端 67―164 に存在するペルオキシソーム移行に係わる領域が ALDP の何らかの構造変化によってマスクされるのかもしれない． 5. Login to comment
38 Subcellular Localization of Wild Type and Mutant ALDP-GFP in CHO ML fraction (mitochondria and light mitochondrial fraction) from CHO cells expressing wild type ALDP and each mutant ALDP-GFP (R104C, G116R, H667D) were fractionated by equilibrium density centrifugation on sucrose. Login to comment
42 Dots in the electrophoretogram in R104C shows the band corresponding to ALDP-GFP fragments. Login to comment
43 168 Vol. 127 (2007) ALDP については ALDP の C 末端に GFP(green ‰uorescent protein)を融合させた変異 ALDP-GFP を発現させるとともに,野生型ヒト ALDP を CHO 細胞に共発現させた(CHO 細胞にも内在性の ALDP が発現しているが,本実験に用いた抗体が交差しないため,ヒト ALDP を発現させた)．GFP 融合タンパク質は内在性のタンパク質との区別が容易であること,安定発現細胞の取得が容易にできることなどの利点がある．この実験では,ペルオキシソームに正常に輸送される変異型 ALDP(R104C, G116R, S606P),ペルオキシソームに局在しない変異型 ALDP(Y174C),発現量が低下している変異型 ALDP(H667D)を選んだ．これら安定過剰発現細胞における ALDP-GFP の細胞内局在性をみると,その分布は一過性発現させた His-ALDP と同様であった．得られた安定発現細胞よりオルガネラ粗分画を調製し,ショ糖密度勾配遠心分離法により各フラクションに分けたのち,SDS-PAGE 及び immunoblotting により変異 ALDP の局在について解析を行った(Fig. 3)．ペルオキシソームマーカーとしてペルオキシソーム膜タンパク質である PMP70 とペルオキシソームの主要なマトリックスタンパク質であるカタラーゼを用いた．野生型 ALDP を安定過剰発現している細胞において,カタラーゼ活性並びに PMP70 が主としてフラクション 3 及び 4 に存在することより,この分画にペルオキシソームが回収されたことが示唆された．また約 110 kDa の分子サイズを持つ ALDP-GFP 並びに 83 kDa の野生型 ALDP は,ペルオキシソームマーカーとほぼ同じ分布を示していたことからペルオキシソームに局在していることが示唆された．また変異型 ALDP-GFP(G116R, S606P)も同様の分布を示した．一方,変異型 ALDP-GFP(H667D)を安定過剰発現している細胞の場合は,ALDP-GFP のバンドは検出されなかった(Fig. 3)．興味深いことに, PMP70 は検出されたが , 共発現させた野生型 ALDP のバンドも検出されなかった．また変異型 ALDP(S606L)についても同様であった．これらの結果は , 変異型 ALDP ( H667D, S606L ) は PMP70 とではなく,野生型 ALDP と複合体を形成し,両者が分解される可能性を示唆している． ABC タンパク質の機能発現に重要である TMD や NBD 以外の C 末端部位での変異がタンパク質の安定性に影響を及ぼすことは興味深い．ALDP の C 末端部位である 600―700 アミノ酸での変異が X-ALD を引き起こす頻度が高いことから,ALDP の C 末端部位はタンパク質の安定性に重要な役割を担っている可能性がある．Liu らは ALDP のダイマー化には C 末端部位(AA.631―745)が重要であると報告している．13) H667D や S606L のような変異は,それ自身あるいは野生型 ALDP とミスフォールドしたダイマーを形成し,異常タンパク質として認識され分解されると考えられる．一方,変異型 ALDP-GFP(R104C)はペルオキシソーム分画に回収されるものの,フラグメント化していること 169 Fig. 4. Login to comment
44 EŠect of Protease Inhibitors on the Stability of ALDP-GFP (H667D) and Wild Type ALDP in CHO Cells CHO cells co-expressing wild type ALDP and ALDP-GFP (H667D) were cultured with each protease inhibitors. Login to comment
49 変異型 ALDP の分解過程の解析新生タンパク質が正しいフ0a9;ールディングを受けることは,そのタンパク質の正常な機能発現のために必須である．遺伝子変異などが存在すると,タンパク質がミスフォールディングされる．このミスフォールドタンパクが細胞外へ分泌されたり,細胞内に蓄積したりすると生体にとって極めて有害になるため,このようなタンパクはプロテアソーム,リソソーム等によって迅速に分解される．ちなみに,嚢胞性線維症の原因タンパク質 CFTR は細胞膜イオンチャネルとして機能する ABC タンパク質であるが,変異 CFTR は小胞体膜からプロテアソームにリクルートされ分解されることが報告されている．32,33) しかしながら,変異型 ALDP を始めとして,ペルオキシソーム膜タンパク質についての解析はほとんど行われていない．変異型 ALDP の一過性発現と安定過剰発現実験より,ALDP(S606L, R617H, H667D, R104C)は, プロテアーゼにより分解されていると推定された．そこで,ALDP-GFP(H667D)を発現している CHO 細胞に各種プロテアーゼ阻害剤を処理し,解析を行った．その結果,プロテアソーム阻害剤である lactacystin を処理した細胞では ALDP-GFP 及び ALDP のバンドが出現した ( Fig. 4 )．一方 , leupeptin, AEBSF, E64d には効果がなかった．また他のプロテアソーム阻害剤である MG132 も有効であった．さらにプロテアソーム阻害剤により分解を逃れた変異型 ALDP-GFP(H667D)の細胞内局在を蛍光抗体法で観察すると,ペルオキシソームに局在していることが確認された．一方,変異型 ALDP(R104C)のフラグメント化は上記プロテアーゼ処理では阻害されなかった．さらに ALD 患者由来細胞の内因性変異 ALDP の分解とプロテアソーム分解系の関与について確認するため,変異型 ALDP(R617H)を持つ患者由来線維芽細胞を用いてタンパク分解の阻害実験を行った．その結果,lactacystin と MG132 処理により, ALDP のバンドが出現した．以上の結果より,ペルオキシソーム膜上にはミスフォールドしたタンパク質を認識する仕組みが存在し,プロテアソーム及び他のプロテアーゼを介して排除していることが示唆された．一方,山田らは ALD 患者線維芽細胞を［35 S］メチオニンでパルスチェイスすることにより,変異型 ALDP(G512S, R660W)の分解が E-64 と leupepu- tin により抑制されることを報告している．34) 彼らの実験ではプロテアソーム阻害剤については実験していないので,プロテアソームの関与は不明であるが,変異型 ALDP の分解には,複数のプロテアーゼが関与している可能性がある． 7. Login to comment
52 Some mutant ALDPs (R104C, G116R, S342P, Q544R and S606P) are normally inserted into the peroxisomal membrane, and others were mislocalized (Y174C) or degraded by proteasome (S606L, R617H and H667D). Login to comment
53 170 Vol. 127 (2007) その結果より,ミスセンス変異 ALDP は以下に示すように 4 種類の細胞内動態を持つことが示された(Fig. 5)．1) 野生型と同様にペルオキシソームに局在するがその機能が阻害されている変異 (R104C, G116R, S342P, Q544R, S606P),2) ペルオキシソームへの局在化に障害がある変異(Y174C), 3) 変異によりタンパク質の安定性が低下しプロテアソームでの分解を受けるが,一部ペルオキシソームに局在する変異(S606L),4) 変異によりタンパク質の安定性が低下しプロテアソームで選択的に分解を受け,細胞内でほとんど確認できない変異 (R617H, H667D)の 4 種類のパターンである．発現量も局在化も正常な変異では,ABC タンパク質としての機能に直接関与している機能ドメインの障害が起こっていると推察される．この中で G116R, S342P は TMD に位置しており,基質の認識や輸送に障害があると推察される．また Q544R, S606P は ATP との結合・加水分解に関与する NBD に位置している．このような変異は,ALDP の ABC タンパク質としての機能を解析するために有益と考えられる．発現量は正常だが局在化に異常が認められた Y174C は,TMD2 と 3 の間のループ 2 に位置しており,この領域が ALDP のペルオキシソームへのターゲッティングに必要であることを示している． ALDP のターゲッティングに必要な領域は 67―164 番目のアミノ酸に存在することが報告されている．20) このことから,Y174C の変異による構造変化のため,ターゲッティングシグナルがマスクされているのかもしれない．このタイプの変異は ALDP のペルオキシソームへの局在化を調べる上で重要と考えられる． ALDP の変異で最も多いミスセンス変異ではその多くが細胞内で分解を受けている．R617H 及び H667D では発現量の著しい低下が認められる．特に安定発現した CHO では immunoblot で検出できなかった．ミスフォールドタンパク質の分解システムの 1 つにプロテアソームによる分解系がある．このタンパク質分解は,生物の様々な高次機能の制御や環境ストレスに応答した恒常性の維持(ストレス応答,タンパク質の品質管理など)に必須な役割を担っている．しかし,小胞体を経由して合成される分泌タンパク質や膜タンパク質に比べて,小胞体を経由しない細胞内タンパク質の品質管理機構はあまり報告されていない．ALDP は遊離のポリソームから直接ペルオキシソームに輸送されるが,この過程でどのように R617H, H667D などの変異が認識され,プロテアソーム系が働いているか興味深い． 171171No. Login to comment
27 df;b9;bb;f3;b9;᜕ᶒఔᢝ௸ ALDP Ĳe;d30;Pde;ᑁ4d5;ɦb; ߟe00;Έe;ឋ˿a;Ife;Ĳb;ఐĴb;Ye3;᪆ ALD <a3;ὅĲe;ᢝ௸᜕ᶒ ALDP Ĳe;a5f;Pfd;,d30;Pde;ᑁc40;ᙠ ឋ,d30;Pde;ᑁĲb;İa;௫Ĵb;b89;b9a;ឋఔYe3;᪆௳Ĵb;௭௼Ĳf;, ALDP Ĳe;ᔜc9;e1;a4;f3;Ĳe;a5f;Pfd;ఔMe5;Ĵb;e0a;௻ᨵᵨĲa;<c5;ᛇ ఔ?d0;f9b;௳Ĵb;௼əd;Ĵf;Ĵc;Ĵb;&#ff0e;ᱯĲb;df;b9;bb;f3;b9;᜕ᶒĲf;,ıf; ௷ıf; 1 ௸Ĳe;a2;df;ce;⏚᜕ᶒĲb;ఐĴb;ᶒe38;௻௢Ĵb;Ĳe;௻ᱯĲb; ‐ᕡdf1;௤&#ff0e;Ĵf;Ĵc;Ĵf;Ĵc;Ĳf; ALD <a3;ὅ௻ᛇȠa;௯Ĵc;௺௤Ĵb; df;b9;bb;f3;b9;᜕ᶒĲe;e2d;İb;఑,TMD İb;఑ 4 ௸(R104C, G116R, Y174C, S342P) ,NBD İb;఑ 4 ௸(Q544R, S606P, S606L, R617H) ,C ʠb;aef;Ze8;f4d;İb;఑ 1 ௸ (H667D)ఔefb;ɢf;Ĳb;⍶ఁ(Fig. 1) ,ıd;Ĳe;a5f;Pfd;௼d30;Pde; ᑁ4d5;ɦb;ఔYe3;᪆௱ıf;&#ff0e;௭Ĵc;఑Ĳe;b9f; a13;Ĳf;,ᜧb66;▾b7;f3;dd; b8;a6;e0;௻ᛇȠa;௱ıf;Ĳe;௻,a73;௱İf;ff0;ఇıf;௤௼əd;௦&#ff0e; ALDP Ĳf;da;eb;aa;ad;b7;bd;fc;e0;Ĳb;İa;௫Ĵb;ᬿ╩⒴ᾦPaa; ⏚Ĳe; b ⏚ᓄĲb;_a2;e0e;௱௺௤Ĵb;௭௼İc;Me5;఑Ĵc;௺௤Ĵb;&#ff0e; b9f;ωb;Ĳb; ALD <a3;ὅᵫᩭĲe;e4a;dad;Rbd;d30;Pde;௻Ĳf;ᬿ╩⒴ᾦPaa; ⏚Ĳe; b ⏚ᓄd3b;ឋİc;b63;e38;Ĳa;dda;dad;Rbd;d30;Pde;௼bd4;ఇ௺d04; 50 ߟ70%a0b;ea6;e1b;c11;௱௺௤Ĵb;&#ff0e;ıd;௭௻[ce;˯f;ɂb;5ca;ఁ᜕ᶒɂb; ALDP Ĳe;a5f;Pfd;ఔNba;a8d;௳Ĵb;ıf;ఉ,ALDP ఔ˿a;Ife;௱௺ ௤Ĳa;௤ ALD <a3;ὅᵫᩭdda;dad;Rbd;d30;Pde;Ĳb;,N ʠb;aef;Ĳb; His bf;b0;ఔed8;4a0;௱ıf;[ce;˯f;ɂb;௼᜕ᶒɂb; ALDP ఔe00;Έe;ឋĲb; ˿a;Ife;௱, &#ff3b;1-14 C]lignoceric acid ఔ9fa;cea;௼௱௺ᬿ╩⒴ ᾦPaa;⏚ b ⏚ᓄd3b;ឋĲe;e2c;b9a;ఔʹc;௷ıf;&#ff0e;ıd;Ĳe;d50;ʧc;, ALDP b20;ʀd;dda;dad;Rbd;d30;Pde;Ĳe;ᬿ╩⒴ᾦPaa;⏚ b ⏚ᓄd3b;ឋ Ĳf;,b63;e38;d30;Pde;Ĳe;d04; 50%ĳe;௻e1b;c11;௱௺௤ıf;İc;,[ce;˯f; ɂb; His-ALDP ఔ˿a;Ife;௯ıb;Ĵb;௼b63;e38;௼Ȝc;a0b;ea6;Ĳb;ĳe;௻ d3b;ឋİc;8de;fa9;௱ıf;&#ff0e;௭Ĳe;௭௼İb;఑˿a;Ife;௯ıb;ıf;[ce;˯f;ɂb; His-ALDP Ĳf; ALDP ௼Ȝc;b49;Ĳe;a5f;Pfd;ఔᢝ௸௭௼İc;Nba; a8d;௯Ĵc;ıf;&#ff0e;e00;Ab9;,9 a2e;ϙe;Ĳe;df;b9;bb;f3;b9;᜕ᶒ ALDP ఔ˿a;Ife;௱ıf;dda;dad;Rbd;d30;Pde;௻Ĳf;ᬿ╩⒴ᾦPaa;⏚ b ⏚ᓄd3b; ឋĲe;ᜉ4a0;Ĳf;a8d;ఉ఑Ĵc;Ĳa;İb;௷ıf;&#ff0e;ఐ௷௺,௭Ĵc;఑Ĳe;df; b9;bb;f3;b9;᜕ᶒ ALDP Ĳf;a5f;Pfd;ఔb20;İf;௭௼İc;Nba;a8d;௯Ĵc; ıf;&#ff0e; ௸௤௻,[ce;˯f;ɂb;5ca;ఁ᜕ᶒɂb; His-ALDP ఔ˿a;Ife;௱ ıf; ALD <a3;ὅdda;dad;Rbd;d30;Pde;ఔ8de;5ce;௱,᜕ᶒɂb; ALDP Ĳe;˿a;Ife;[cf;ఔ immunoblotting Ĳb;ఐĴa;b9a;[cf;ᓄ௱Ye3;᪆௱ ıf;(Table 1) &#ff0e;Ĳa;İa; ALDP Ĳe;˿a;Ife;[cf;Ĳf;,da;eb;aa;ad; b7;bd;fc;e0;Ĳe;ᢣa19;⏗d20;௻௢Ĵb;ab;bf;e9;fc;bc;Ĳe;˿a;Ife;[cf;௻Xdc; b63;௱ıf;&#ff0e;ıd;Ĳe;d50;ʧc;,᜕ᶒɂb; ALDP(R104C, G116R, Y174C, S342P, Q544R, S606P)Ĳf;,[ce;˯f;ɂb;௼ĳb;ĳc; Ȝc;a0b;ea6;Ĳe;˿a;Ife;[cf;ఔ̙a;௱ıf;&#ff0e;e00;Ab9;,᜕ᶒɂb; ALDP (S606L, R617H, H667D)௻Ĳf;˿a;Ife;[cf;İc;[ce;˯f;ɂb;Ĳe;˿a; 167 Table 1. Login to comment
34 167 No. 1 Ife;[cf;௼bd4;ఇ௺d04; 50%a0b;ea6;e1b;c11;௱௺௤ıf;&#ff0e;Ĳa;İa;,ᔜ ALDP dd;b8;c6;a3;d6;Ĳe;d30;Pde;Ĳf;d04; 30%a0b;ea6;௻௢Ĵa;,ᔜ d30;Pde;╹௻Ĳe;˿a;Ife;4b9;᳛Ĳb;ᨵɢf;Ĳa;dee;Ĳf;a8d;ఉ఑Ĵc;Ĳa;İb;௷ ıf;&#ff0e;௭Ĳe;௭௼İb;఑,ALDP Ĳe;˿a;Ife;[cf;İc;e1b;c11;௱௺௤ ıf; 3 ௸Ĳe;᜕ᶒ ALDP Ĳf;d30;Pde;ᑁ௻Ĳe;b89;b9a;ឋİc;f4e;e0b;௱ ௺௤Ĵb;௼?a8;bdf;௯Ĵc;ıf;&#ff0e;ĳe;ıf;‐ᕡdf1;௤௭௼Ĳb; S606P ௼ S606L Ĳf;Ȝc;௲Ze8;f4d;Ĳe;᜕ᶒĲb;ఊfc2;Ĵf;఑ıa;,f6e;?db;௱ ıf;a2;df;ce;⏚Ĳb;ఐ௷௺˿a;Ife;[cf;Ĳb;Ĳf;dee;İc;a8d;ఉ఑Ĵc;ıf;&#ff0e; ௸௤௻,᜕ᶒɂb; His-ALDP Ĳe;d30;Pde;ᑁc40;ᙠఔVcd;ᐝ ᢙf53;cd5;௻Nba;a8d;௱ıf;&#ff0e;᜕ᶒɂb; ALDP(R104C, G116R, S342P, Q544R, S606P, S606L)௻Ĳf; ALDP İc;ab;bf; e9;fc;bc;Ĳe;c40;ᙠ௼e00;Qf4;௱ıf;௭௼İb;఑,b63;e38;Ĳb;da;eb;aa;ad; b7;bd;fc;e0;ఆc40;ᙠ௱௺௤Ĵb;௭௼İc;Nba;a8d;௯Ĵc;ıf;&#ff0e;e00;Ab9;, ᜕ᶒɂb; ALDP(Y174C, H667D)௻Ĳf;c40;ᙠİc;e00;Qf4;ıb; ıa;,ALDP İc;ed6;Ĳe;d30;Pde;ᑁc0f;ᘤb98;ఆ╹⍟௷௺f38;〈௯ Ĵc;௺௤Ĵb;௼ὃ௨఑Ĵc;ıf;&#ff0e;᜕ᶒɂb; ALDP(R617H) ௻Ĳf; ALDP Ĳe;˿a;Ife;İc;a8d;ఉ఑Ĵc;Ĳa;İb;௷ıf;&#ff0e;᜕ᶒɂb; ALDP(R104C, G116R, S342P, Q544R, S606P)௻ Ĳf;[ce;˯f;ɂb;௼ĳb;ĳc;Ȝc;a0b;ea6;Ĳe;bf;f3;d1;af;[cf;İc;˿a;Ife;௱,da;eb; aa;ad;b7;bd;fc;e0;ఆĲe;c40;ᙠఊNba;a8d;௯Ĵc;ıf;Ĳe;௻,௭Ĵc;఑Ĳe; ᜕ᶒɂb; ALDP Ĳf;ᔠᡂ௯Ĵc;ıf;Ĳe;௵Ĳb;b63;e38;Ĳb;da;eb;aa;ad; b7;bd;fc;e0;Ĳb;Έb;௾Ĵc;Ĵb;İc;,da;eb;aa;ad;b7;bd;fc;e0;̳c;Ĳb;İa;௤ ௺ıd;Ĳe;a5f;Pfd;(ATP d50;ᔠfb;4a0;c34;ᑖYe3;Re5;௱İf;Ĳf;9fa;cea;f38; 〈)Ĳb;ᶒe38;ఔᢝ௸௭௼İc;?a8;bdf;௯Ĵc;ıf;&#ff0e;ᱯĲb; R104C, G116R, S342P Ĳf; TMD Ĳb;b58;ᙠ௳Ĵb;௭௼İb;఑ ALDP Ĳe;9fa;cea;f38;〈Pfd;İc;᜕ᓄ௱௺௤Ĵb;௼ὃ௨఑Ĵc;Ĵb;&#ff0e;e00;Ab9;, NBD Ĳb;b58;ᙠ௳Ĵb; Q544R, S606P Ĳf; ATP d50;ᔠfb;4a0;c34; ᑖYe3;Ĳb;f71;aff;ఔe0e;௨௺௤Ĵb;5ef;Pfd;ឋİc;ὃ௨఑Ĵc;Ĵb;&#ff0e;ĳe;ıf; S606P, S606L Ĳf;᜕ᶒİc;Ȝc;௲Ze8;f4d;௻ఊEcb;⌼ḄĲb;b89;b9a; ឋİc;ᶒĲa;௷௺௤ıf;&#ff0e;Roerig ఑Ĳf; S606L Ĳe;᜕ᶒɂb; ALDP Ĳf;,ATP ௼Ĳe;Yaa;Ȥc;ឋİc;f4e;e0b;௱௺௤Ĵb;e00;Ab9;௻ ATP 4a0;c34;ᑖYe3;Ĳf;b63;e38;Ĳb;ʹc;Ĵf;Ĵc;௺௤Ĵb;௼ᛇȠa;௱௺௤ Ĵb;&#ff0e; 29) ௭Ĳe;௭௼Ĳf; ALDP ௼ ATP Ĳe;Yaa;Ȥc;ឋİc; ALDP Ĳe;b89;b9a;ឋĲb;ఊf71;aff;ఔ5ca;ĳc;௱௺௤Ĵb;5ef;Pfd;ឋఔ̙a;௱௺௤ Ĵb;&#ff0e;S606L ௼ S606P Ĳe;b89;b9a;ឋĲe;⍟௤௼a5f;Pfd;Ĳe;_a2;fc2; Ĳf; ALDP Ĳe;a5f;Pfd;ఔMe5;Ĵb;e0a;௻ఊ‐ᕡdf1;௤Fb9;௻௢Ĵa;, eca;f8c;௯఑Ĳb;ʳc;a0e;ఔʹc;௦fc5;⌕İc;௢Ĵb;&#ff0e;e00;Ab9;,Y174C Ĳe;᜕ᶒɂb; ALDP Ĳf;b63;e38;Ĳb;˿a;Ife;௳Ĵb;Ĳb;ఊfc2;Ĵf;఑ıa;, da;eb;aa;ad;b7;bd;fc;e0;ఆc40;ᙠıb;ıa;ed6;Ĳe;d30;Pde;ᑁc0f;ᘤb98;ఆdf; b9;bf;fc;b2;c3;c6;a3;f3;b0;௱ıf;&#ff0e;௭Ĵc;ĳe;௻Ĳb;da;eb;aa;ad;b7; bd;fc;e0;ఆĲe;c40;ᙠᓄb7;b0;ca;eb;ఔb20;İf;da;eb;aa;ad;b7;bd;fc;e0; ̳c;bf;f3;d1;af;cea;Ĳf;,Ϗe;ᱯᶒḄĲb;df;c8;b3;f3;c9;ea;a2;ఌc0f;Pde; f53;Ĳb;Ofb;ʹc;௳Ĵb;௭௼İc;Me5;఑Ĵc;௺௤Ĵb;&#ff0e; 30,31) ఐ௷௺, ALDP Ĳe; TMD2ߟ3 Ĳe;╹Ĳe;eb;fc;d7;Ĳf;,da;eb;aa;ad;b7; bd;fc;e0;ఆĲe;c40;ᙠᓄĲb;[cd;⌕Ĳa;f79;ᒘఔʧc;ıf;௱௺௤Ĵb;5ef;Pfd; ឋİc;?a8;bdf;௯Ĵc;Ĵb;&#ff0e;Pex19p b58;ᙠᓄ௻Ĳe; in vitro bf;f3; d1;af;cea;ffb;a33;cfb;Ĳb;İa;௤௺,ALDP(Y174C)Ĳf; Pex19p Ĳb;d50;ᔠ௻İd;Ĵb;Ĳe;௻,ALDP Ĳe; N ʠb;aef; 67ߟ164 Ĳb;b58;ᙠ௳Ĵb;da;eb;aa;ad;b7;bd;fc;e0;Ofb;ʹc;Ĳb;fc2;Ĵf;Ĵb;♚9df;İc; ALDP Ĳe;f55;఑İb;Ĳe;Ecb;⌼᜕ᓄĲb;ఐ௷௺de;b9;af;௯Ĵc;Ĵb; Ĳe;İb;ఊ௱Ĵc;Ĳa;௤&#ff0e; 5. Login to comment
41 168 Vol. 127 (2007) ALDP Ĳb;௸௤௺Ĳf; ALDP Ĳe; C ʠb;aef;Ĳb; GFP(green ߮uorescent protein)ఔͮd;ᔠ௯ıb;ıf;᜕ᶒ ALDP-GFP ఔ˿a;Ife;௯ıb;Ĵb;௼௼ఊĲb;,[ce;˯f;ɂb;d2;c8; ALDP ఔ CHO d30;Pde;Ĳb;ᐳ ˿a;Ife;௯ıb;ıf;(CHO d30;Pde;Ĳb;ఊ ᑁᙠឋĲe; ALDP İc;˿a;Ife;௱௺௤Ĵb;İc;,ʠc;b9f; a13;Ĳb;ᵨ௤ıf;ᢙf53;İc; ea4;dee;௱Ĳa;௤ıf;ఉ,d2;c8; ALDP ఔ˿a;Ife;௯ıb;ıf;) &#ff0e;GFP ͮd;ᔠbf;f3;d1;af;cea;Ĳf;ᑁᙠឋĲe;bf;f3;d1;af;cea;௼Ĳe;ȕa;ᑩİc;bb9; ᧕௻௢Ĵb;௭௼,b89;b9a;˿a;Ife;d30;Pde;Ĳe;5d6;f97;İc;bb9;᧕Ĳb;௻İd;Ĵb; ௭௼Ĳa;௽Ĳe;ᑭFb9;İc;௢Ĵb;&#ff0e;௭Ĳe;b9f; a13;௻Ĳf;,da;eb;aa;ad;b7; bd;fc;e0;Ĳb;b63;e38;Ĳb;f38;〈௯Ĵc;Ĵb;᜕ᶒɂb; ALDP(R104C, G116R, S606P) ,da;eb;aa;ad;b7;bd;fc;e0;Ĳb;c40;ᙠ௱Ĳa;௤᜕ ᶒɂb; ALDP(Y174C) ,˿a;Ife;[cf;İc;f4e;e0b;௱௺௤Ĵb;᜕ᶒ ɂb; ALDP(H667D)ఔ⍶క௴&#ff0e;௭Ĵc;఑b89;b9a;Έe;ᒖ˿a; Ife;d30;Pde;Ĳb;İa;௫Ĵb; ALDP-GFP Ĳe;d30;Pde;ᑁc40;ᙠឋఔĳf;Ĵb; ௼,ıd;Ĳe;ᑖe03;Ĳf;e00;Έe;ឋ˿a;Ife;௯ıb;ıf; His-ALDP ௼Ȝc; Ed8;௻௢௷ıf;&#ff0e; f97;఑Ĵc;ıf;b89;b9a;˿a;Ife;d30;Pde;ఐĴa;aa;eb;ac;cd;e9;c97;ᑖ˱b;ఔabf; Xfd;௱,b7;e7;cd6;bc6;ea6;4fe;Βd;⍤fc3;ᑖ`e2;cd5;Ĳb;ఐĴa;ᔜd5;e9;af;b7; e7;f3;Ĳb;ᑖ௫ıf;Ĳe;௵,SDS-PAGE 5ca;ఁ immunoblotting Ĳb;ఐĴa;᜕ᶒ ALDP Ĳe;c40;ᙠĲb;௸௤௺Ye3;᪆ఔʹc;௷ ıf;(Fig. 3) &#ff0e;da;eb;aa;ad;b7;bd;fc;e0;de;fc;ab;fc;௼௱௺da; eb;aa;ad;b7;bd;fc;e0;̳c;bf;f3;d1;af;cea;௻௢Ĵb; PMP70 ௼da;eb; aa;ad;b7;bd;fc;e0;Ĳe;e3b;⌕Ĳa;de;c8;ea;c3;af;b9;bf;f3;d1;af;cea;௻௢ Ĵb;ab;bf;e9;fc;bc;ఔᵨ௤ıf;&#ff0e;[ce;˯f;ɂb; ALDP ఔb89;b9a;Έe;ᒖ ˿a;Ife;௱௺௤Ĵb;d30;Pde;Ĳb;İa;௤௺,ab;bf;e9;fc;bc;d3b;ឋe26;ఁĲb; PMP70 İc;e3b;௼௱௺d5;e9;af;b7;e7;f3; 3 5ca;ఁ 4 Ĳb;b58;ᙠ௳ Ĵb;௭௼ఐĴa;,௭Ĳe;ᑖ˱b;Ĳb;da;eb;aa;ad;b7;bd;fc;e0;İc;8de;5ce;௯ Ĵc;ıf;௭௼İc;̙a;ᖂ௯Ĵc;ıf;&#ff0e;ĳe;ıf;d04; 110 kDa Ĳe;ᑖb50;b5; a4;ba;ఔᢝ௸ ALDP-GFP e26;ఁĲb; 83 kDa Ĳe;[ce;˯f;ɂb; ALDP Ĳf;,da;eb;aa;ad;b7;bd;fc;e0;de;fc;ab;fc;௼ĳb;ĳc;Ȝc;௲ ᑖe03;ఔ̙a;௱௺௤ıf;௭௼İb;఑da;eb;aa;ad;b7;bd;fc;e0;Ĳb;c40;ᙠ ௱௺௤Ĵb;௭௼İc;̙a;ᖂ௯Ĵc;ıf;&#ff0e;ĳe;ıf;᜕ᶒɂb; ALDP-GFP(G116R, S606P)ఊȜc;Ed8;Ĳe;ᑖe03;ఔ̙a;௱ıf;&#ff0e; e00;Ab9;,᜕ᶒɂb; ALDP-GFP(H667D)ఔb89;b9a;Έe;ᒖ ˿a;Ife;௱௺௤Ĵb;d30;Pde;Ĳe;ᛊᔠĲf;,ALDP-GFP Ĳe;d0;f3;c9; Ĳf;ʳc;3fa;௯Ĵc;Ĳa;İb;௷ıf;(Fig. 3) &#ff0e;‐ᕡdf1;௤௭௼Ĳb;, PMP70 Ĳf; ʳc; 3fa; ௯ Ĵc; ıf; İc; , ᐳ ˿a; Ife; ௯ ıb; ıf; [ce; ˯f; ɂb; ALDP Ĳe;d0;f3;c9;ఊʳc;3fa;௯Ĵc;Ĳa;İb;௷ıf;&#ff0e;ĳe;ıf;᜕ᶒɂb; ALDP(S606L)Ĳb;௸௤௺ఊȜc;Ed8;௻௢௷ıf;&#ff0e;௭Ĵc;఑ Ĳe; d50; ʧc; Ĳf; , ᜕ ᶒ ɂb; ALDP ( H667D, S606L ) Ĳf; PMP70 ௼௻Ĳf;Ĳa;İf;,[ce;˯f;ɂb; ALDP ௼⋋ᔠf53;ఔf62;ᡂ ௱,e21;ὅİc;ᑖYe3;௯Ĵc;Ĵb;5ef;Pfd;ឋఔ̙a;ᖂ௱௺௤Ĵb;&#ff0e; ABC bf;f3;d1;af;cea;Ĳe;a5f;Pfd;˿a;Ife;Ĳb;[cd;⌕௻௢Ĵb; TMD ఌ NBD ee5;᜜Ĳe; C ʠb;aef;Ze8;f4d;௻Ĳe;᜕ᶒİc;bf;f3;d1;af;cea;Ĳe;b89; b9a;ឋĲb;f71;aff;ఔ5ca;ĳc;௳௭௼Ĳf;‐ᕡdf1;௤&#ff0e;ALDP Ĳe; C ʠb;aef;Ze8;f4d;௻௢Ĵb; 600ߟ700 a2;df;ce;⏚௻Ĳe;᜕ᶒİc; X-ALD ఔf15;İd;d77;௭௳ϗb;ea6;İc; ad8;௤௭௼İb;఑,ALDP Ĳe; C ʠb;aef;Ze8;f4d;Ĳf;bf;f3;d1;af;cea;Ĳe;b89;b9a;ឋĲb;[cd;⌕Ĳa;f79;ᒘఔ>c5; ௷௺௤Ĵb;5ef;Pfd;ឋİc;௢Ĵb;&#ff0e;Liu ఑Ĳf; ALDP Ĳe;c0;a4; de;fc;ᓄĲb;Ĳf; C ʠb;aef;Ze8;f4d;(AA.631ߟ745)İc;[cd;⌕௻ ௢Ĵb;௼ᛇȠa;௱௺௤Ĵb;&#ff0e; 13) H667D ఌ S606L Ĳe;ఐ௦Ĳa; ᜕ᶒĲf;,ıd;Ĵc;Qea;eab;௢Ĵb;௤Ĳf;[ce;˯f;ɂb; ALDP ௼df;b9;d5; a9;fc;eb;c9;௱ıf;c0;a4;de;fc;ఔf62;ᡂ௱,ᶒe38;bf;f3;d1;af;cea;௼ ௱௺a8d;b58;௯Ĵc;ᑖYe3;௯Ĵc;Ĵb;௼ὃ௨఑Ĵc;Ĵb;&#ff0e;e00;Ab9;,᜕ᶒ ɂb; ALDP-GFP(R104C)Ĳf;da;eb;aa;ad;b7;bd;fc;e0;ᑖ˱b; Ĳb;8de;5ce;௯Ĵc;Ĵb;ఊĲe;Ĳe;,d5;e9;b0;e1;f3;c8;ᓄ௱௺௤Ĵb;௭௼ 169 Fig. 4. Login to comment

PMID: 20799350 [PubMed] Kelly L et al: "Functional hot spots in human ATP-binding cassette transporter nucleotide binding domains."

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50 Disease-associated nsSNPs at Three Structural Hotspots in Human ABC Transporter NBDs Gene Disease Position ARA motif ABCB11 BRIC2 A570T ABCD1 X-ALD A616V CFTR CF A559T ABCC6 PXE R765Q ABCC8 HHF1 R841G ABCC8 HHF1 R1493Q ABCC8 HHF1 R1493W ABCD1 X-ALD R617C ABCD1 X-ALD R617G ABCD1 X-ALD R617H CFTR CF R560K CFTR CF R560S CFTR CF R560T ABCA1 HDLD1 A1046D ABCB4 ICP A546D C-loop 1 motif ABCC8 HHF1 D1471H ABCC8 HHF1 D1471N CFTR CBAVD G544V ABCC8 HHF1 G1478R C-loop2 motif ABCA4 STGD1 H2128R ABCC8 HHF1 K889T ABCD1 X-ALD R660P ABCD1 X-ALD R660W ABCA1 HDLD2 M1091T ABCA4 STGD1 E2131K ABCA12 LI2 E1539K ABCA4 STGD1 and CORD3 E1122K CFTR CF L610S ABCC8 HHF1 L1543P ABCA1 Colorectal cancer sample; somatic mutation A2109T ABCC9 CMD1O A1513T ABCD1 X-ALD H667D CFTR CF A613T ABCA1 HDLD2 D1099Y ABCD1 X-ALD T668I CFTR CF D614G ABCA4 STGD1 R2139W ABCA4 STGD1 R1129C ABCA4 ARMD2, STGD1, and FFM R1129L Disease abbreviations are as follows: BRIC2, benign recurrent intrahepatic cholestasis type 2; X-ALD, X-linked adrenoleukodystrophy; CF, cystic fibrosis; PXE, Pseudoxanthoma elasticum; HHF1, familial hyperinsulinemic hypoglycemia-1; HDLD1, high density lipoprotein deficiency type 1; ICP, intrahepatic cholestasis of pregnancy; CBAVD, congenital bilateral absence of the vas deferens; STGD1, Stargardt disease type 1; HDLD2, high density lipoprotein deficiency type 2; LI2, ichthyosis lamellar type 2; CORD3, cone-rod dystrophy type 3; CMD1O, cardiomyopathy dilated type 1O; ARMD2, age-related macular degeneration type 2; FFM, fundus flavimaculatus. Login to comment